Tecnología del ADN

Pregunta esencial

¿Cómo copian, separan y comparan el ADN los científicos?

Una muestra de ADN de la escena de un crimen o de un familiar puede ser muy pequeña. Los científicos usan la PCR para hacer muchas copias, la electroforesis en gel para separar los pedazos por tamaño y los perfiles de ADN para comparar personas. En esta lección aprenderás cómo funciona cada herramienta y cómo leer los resultados.

Cómo copiar ADN con la PCR

• PCR significa reacción en cadena de la polimerasa
• Produce millones de copias de una sección elegida del ADN
• Cada ciclo tiene tres pasos: desnaturalización, alineamiento y extensión
• Cada ciclo duplica el número de copias: después de n ciclos, 2ⁿ copias

La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) copia una sección elegida de ADN en un tubo de ensayo. Kary Mullis la desarrolló en 1983. Cada ciclo tiene tres pasos. Primero, el calentamiento a unos 95 grados C separa las dos cadenas (desnaturalización). Segundo, el enfriamiento a unos 55 grados C permite que pedazos cortos de ADN llamados cebadores se unan a las cadenas al inicio de la sección que se va a copiar (alineamiento). Tercero, a unos 72 grados C, la ADN polimerasa construye una cadena nueva a partir de cada original, como en la replicación del ADN (extensión). La enzima que se usa es la ADN polimerasa Taq, de una bacteria que vive en el calor, porque no pierde su forma a 95 grados C (consulta Enzimas, Unidad 5). Un ciclo produce 2 copias a partir de 1, y cada ciclo duplica el número: después de n ciclos hay 2ⁿ copias. Treinta ciclos dan 2³⁰, cerca de 1.07 x 10⁹ copias.

Cómo separar ADN con electroforesis en gel

• El ADN se corta en fragmentos con una enzima de restricción
• Los fragmentos se colocan en pocillos de un gel
• Una corriente eléctrica mueve el ADN, que tiene carga negativa, hacia el extremo +
• Los fragmentos pequeños se mueven más lejos que los grandes

La electroforesis en gel separa fragmentos de ADN por tamaño. Una enzima de restricción es una proteína que corta el ADN en una secuencia específica. Por ejemplo, la enzima EcoRI corta en la secuencia GAATTC. Los fragmentos cortados se colocan en pocillos en el extremo negativo de un gel, y se aplica una corriente eléctrica. El ADN tiene carga negativa por los grupos fosfato de su esqueleto, así que se mueve hacia el extremo positivo. El gel es una malla, así que los fragmentos pequeños se mueven más lejos que los grandes en el mismo tiempo. Una escalera de ADN es una mezcla de fragmentos de tamaños conocidos. Al comparar las bandas de una muestra con la escalera se obtiene el tamaño de cada fragmento en pares de bases (pb). Los tamaños de los fragmentos de una molécula de ADN cortada suman su tamaño original, como en el diagrama, donde los dos carriles suman 6,000 pb.

Huellas de ADN

• Un perfil de ADN compara sitios donde varía el número de repeticiones cortas
• Cada persona tiene un patrón distinto, excepto los gemelos idénticos
• Dos perfiles coinciden solo si todas las bandas se alinean
• Una coincidencia es congruente con el sospechoso, pero por sí sola no es una prueba

Algunos tramos del ADN humano son secuencias cortas que se repiten una tras otra, llamadas repeticiones cortas en tándem (STR). El número de repeticiones en cada sitio es distinto de una persona a otra. Para hacer un perfil de ADN, los científicos copian los sitios STR con PCR y separan los fragmentos por tamaño. Cada fragmento es una banda, y dos perfiles de la misma persona se alinean. En Estados Unidos, los laboratorios forenses comparan unos 20 sitios STR. Los perfiles también muestran relaciones familiares, porque un hijo recibe la mitad de sus bandas de cada progenitor. Si aunque sea una banda no coincide, la persona queda excluida. Si todas las bandas coinciden, la persona es congruente con la muestra, y el laboratorio informa la probabilidad de que una persona sin parentesco coincida por casualidad. Los gemelos idénticos tienen el mismo ADN, así que comparten un perfil.

↑ Volver arriba

---

Ejemplos resueltos

Primero intenta resolver cada problema por tu cuenta y luego abre la solución para revisar tu trabajo.

Ejemplo 1: Número de copias en la PCR

Una reacción de PCR empieza con 1 copia de una sección de ADN. (a) ¿Cuántas copias hay después de 10 ciclos? (b) Otra reacción empieza con 5 copias. ¿Cuántas copias hay después de 12 ciclos? (c) ¿Cuál es el menor número de ciclos que produce más de 1 millón de copias a partir de 1 copia?

Mostrar la solución

1. (a) Después de 10 ciclos: Cada ciclo duplica el número de copias, así que copias = 1 x 2¹⁰ = 1,024.
2. (b) Con 5 copias al inicio: Copias = 5 x 2¹² = 5 x 4,096 = 20,480.
3. (c) Más de 1 millón: 2¹⁹ = 524,288 es menos de 1,000,000. 2²⁰ = 1,048,576 es más de 1,000,000. Así que se necesitan 20 ciclos.
4. Respuesta: (a) 1,024 copias. (b) 20,480 copias. (c) 20 ciclos.

Ejemplo 2: Estima el tamaño de los fragmentos a partir de un gel

Un plásmido circular se corta con una enzima. La escalera y la muestra están en el mismo gel. Las bandas de la muestra están en 28 mm y 45 mm. Usa la curva estándar para estimar el tamaño de cada fragmento y el tamaño del plásmido.

Mostrar la solución

1. Lee la primera banda: En la curva estándar, sube desde 28 mm hasta la línea y luego ve hacia el eje del tamaño de los fragmentos. Esto da cerca de 2,500 pb.
2. Lee la segunda banda: Desde 45 mm hasta la línea y luego hacia el eje da cerca de 700 pb. La banda se movió más lejos, así que es el fragmento más pequeño.
3. Suma los fragmentos: Los fragmentos de un plásmido cortado suman el tamaño del plásmido: 2,500 + 700 = 3,200 pb.
4. Respuesta: Cerca de 2,500 pb y 700 pb, así que el plásmido mide cerca de 3,200 pb.

Ejemplo 3: Compara perfiles de ADN

El ADN de la escena de un crimen (Evidencia) se compara con el de tres sospechosos. (a) ¿El perfil de qué sospechoso coincide con la Evidencia? (b) ¿Por qué se excluye al Sospechoso 1? (c) ¿Una coincidencia demuestra que el sospechoso dejó el ADN en la escena?

Mostrar la solución

1. (a) Busca bandas alineadas: Todas las bandas del Sospechoso 2 se alinean con la Evidencia (16, 25, 33, 42 y 53 mm). El Sospechoso 2 coincide.
2. (b) Sospechoso 1: Dos bandas no se alinean: el Sospechoso 1 tiene bandas en 29 y 46 mm donde la Evidencia tiene bandas en 25 y 42 mm. Una sola diferencia excluye a una persona.
3. (c) Una coincidencia: No. Una coincidencia significa que el perfil es congruente con el sospechoso. Otra persona, como un gemelo idéntico, podría compartirlo. Los laboratorios comparan unos 20 sitios y dan la probabilidad de una coincidencia al azar, y además se necesita otra evidencia.
4. Respuesta: (a) Sospechoso 2. (b) Dos bandas no coinciden. (c) No, una coincidencia es congruente con el sospechoso, pero por sí sola no es una prueba.

↑ Volver arriba

---

Práctica

Practica cómo calcular el número de copias en la PCR, estimar el tamaño de fragmentos a partir de un gel, leer un gel de paternidad y explicar por qué funcionan las herramientas. Inténtalo primero por tu cuenta y luego revisa tu trabajo con la clave de respuestas.

• Hoja de práctica: Tecnología del ADN (PDF) (en inglés)
• Clave de respuestas: Tecnología del ADN (PDF) (en inglés)

↑ Volver arriba

---

Diapositivas de la lección

• Diapositivas 10.8: Tecnología del ADN (PDF) (en inglés)

↑ Volver arriba

---

Ideas clave

• La PCR produce millones de copias de una sección elegida de ADN
• Cada ciclo duplica el número de copias: 2ⁿ después de n ciclos
• Las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas
• La electroforesis en gel separa los fragmentos por tamaño, y los fragmentos pequeños llegan más lejos
• Los perfiles de ADN comparan personas: una diferencia excluye y una coincidencia es congruente

De vuelta a la pregunta esencial: los científicos copian el ADN con la PCR, separan los fragmentos por tamaño con la electroforesis en gel y comparan perfiles de ADN al alinear bandas. Cada herramienta usa una propiedad del ADN: una polimerasa lo puede copiar, tiene carga negativa y la longitud de las secuencias repetidas es distinta de una persona a otra. A continuación verás cómo se puede colocar el ADN de un organismo en otro.

↑ Volver arriba

---

↑ Volver arriba